August 14, 2020

The Niche

Knoepfler lab stem cell blog

STAP再現実験をより明解にするための1つの提案

By Jun Seita, M.D., Ph.D.

Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

English version is here.

Oct3/4プロモーターに制御されたGFP蛍光タンパク質の発現を検出することは、オリジナルのSTAP論文[1, 2]においてSTAP細胞の定義として広範囲にわたって使用されています。そして同じ手法はSTAP論文の再現を目指す様々な第三者にも利用されています。一方、ストレスや障害を受けた細胞が自家蛍光を発することは良く知られた現象です。これはSTAP細胞について議論する時に特に重要です。様々な外部刺激はOct3/4-GFPレポーターの活性化とは独立して自家蛍光の発現を促す可能性があるからです。フローサイトーメーターも蛍光顕微鏡も観察した蛍光の起源を、例えばGFP由来と特定することは出来ません。これらの機器は使用された励起光の種類と光学フィルターによって決定される、特定の波長域を持った光子の強度を測定するだけです。Oct3/4-GFP由来のシグナルを自家蛍光から区別することは、STAP細胞の再現実験において極めて重要な第一歩となります。すなわち、すでに著者達から発表されたプロトコール[3]をなぞるだけでは、弱酸処理によって終末分化細胞がOct3/4-GFPを発現する細胞に変化する、と確信するには不十分な可能性が示唆されます。

そこで、フローサイトーメトリーをよく使う一人の幹細胞生物学者として、プロトコールに1つのコントロールの追加を提案したいと思います。

Oct3/4-GFP遺伝子改変マウスから採取した細胞に追加して、野生型マウスからも同じ手順で細胞を採取し、同じ手順で外部刺激処理・培養し、同じ条件で解析を行ってください。 

Oct3/4-GFP遺伝子改変マウスか野生型か、以外のすべての要素、マウスの系統、性別や週齢、弱酸処理の手順やそれに続く培養など、は同一である必要があります。これがOct3/4-GFPシグナルを自家蛍光から区別する唯一のコントロールとなります。この手法はFluorescence-minus-one (FMO) コントロールと呼ばれており、今日のフローサイトメトリーでは陽性細胞と陰性細胞の境界を決定するもっとも信頼のおける方法です。自家蛍光の波長分布や強度は、その細胞の状態に依存するので、ストレスを与えていないが培養した細胞はこの区別のためのコントロールとしては不適切です。これはプロトコールへのコントロールの追加であって、プロトコール自体を改変するものでないことにご留意ください。

Nature letter[2]のExtended Data Figure 5gに掲載されたフローサイトメトリーのデータは、コントロールの適切さ、そして更にいくつかの要素について再検討する必要性を示唆しました。フローサイトメトリーを行う場合には、各サンプルは全く同じ設定で観察する必要があります。検出の感度を決定する光電子倍増管の電圧設定や蛍光漏れ込み補正の設定は、実際のデータを取得する前に最適化し、サンプルとサンプルの間で変更するべきではありません。また論文の図表に掲載されたフローサイトメトリーの各プロットには観察に使用した蛍光色素・タンパク質の種類を明記することが推奨されています。発表された論文とプロトコール[1-3]を参照すると、eBioscienceが供給する抗CD90抗体は29種類、Abcamが供給する抗CD19抗体には22種類、Abcamが供給する抗CD34抗体には4種類、R&D Systemsが供給する抗Integrin alpha 7抗体には7種類の選択肢があります。この多様な選択肢は著者のプロトコールを正確に再現することを難しくしています。さらに、ほとんどの蛍光色素・タンパク質の蛍光波長域は、その蛍光色素・タンパク質用の検出器の検出波長域を超えて広がっているため、周囲の検出器へシグナルが漏れ込みます。そのため実験者は蛍光漏れ込み補正を行う必要があります。そして蛍光色素・タンパク質の組み合わせ、例えばGFPとPEと自家蛍光を同時に観察する場合、によっては漏れ込みを完全に補正することが難しいことが知られています。ですから使用された蛍光色素・タンパク質の組み合わせを知ることは、論文の図表に掲載されたフローサイトメトリーのプロットを解釈する際に極めて重要となります。もし電圧設定、蛍光漏れ込み補正、蛍光色素の組み合わせの選択やFMOが身近でない場合、フローサイトメトリー機器室の専門家に相談することを強くお勧めします。

この1つの、しかし重要なコントロールの追加はSTAP細胞の再現実験の結果をより明解にすると考えます。

 

References

1. Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency.

Obokata H, Wakayama T, Sasai Y, Kojima K, Vacanti MP, Niwa H, Yamato M, Vacanti CA.

Nature. 2014 Jan 30;505(7485):641-7. doi: 10.1038/nature12968.

PMID: 24476887

 

2. Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency.

Obokata H, Sasai Y, Niwa H, Kadota M, Andrabi M, Takata N, Tokoro M, Terashita Y, Yonemura S, Vacanti CA, Wakayama T.

Nature. 2014 Jan 30;505(7485):676-80. doi: 10.1038/nature12969.

PMID: 24476891

 

3. Essential technical tips for STAP cell conversion culture from somatic cells

Haruko Obokata, Yoshiki Sasai & Hitoshi Niwa

STAP Group RIKEN CDB

Protocol Exchange (2014) doi:10.1038/protex.2014.008

Published online 5 March 2014

 

4. Modern flow cytometry: a practical approach.

Tung JW, Heydari K, Tirouvanziam R, Sahaf B, Parks DR, Herzenberg LA, Herzenberg LA.

Clin Lab Med. 2007 Sep;27(3):453-68, v. Review.

PMID: 17658402

 

 

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