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STAP Cell Update: STAP-like paper, Real Origin of STAP cells

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The STAP cell mess that began in January of this year has in some ways quieted down. In a broader sense, I believe that STAP is now and will be in the future viewed as a scandal that revealed some less than ideal aspects to the world of biomedical science and publishing. Where does this …

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Harvard STAP cell authors release new protocol, affirm belief in phenomenon

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Even as everyone was going through the Science and Nature reviews of the rejected STAP papers this week, something else on the STAP front that happened last week. What’s up? Well, the STAP Nature papers are retracted, RIKEN CDB is going to be reorganized, RIKEN CDB has tried at least 22 times to make STAP …

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Obokata OKs Retraction of Nature STAP Cell Letter, Not Article

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Japanese news media are reporting that Haruko Obokata and other key authors have agreed to retract the Nature STAP cell letter, but not the Nature article. This is a major development and a peculiar one because to many in the  field it is the Nature STAP cell article that is the more flawed of the two Nature papers on STAP. Why would …

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Perspectives on Lee Lab F1000 Paper that STAP Cell Method Does Not Work

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A paper has been published reporting that repeated attempts to make so-called “acid bath stem cells” have failed. At the end of January it was claimed in two Nature papers that a mild acid treatment created pluripotent or even totipotent stem cells that that the authors termed “STAP cells” or “STAP stem cells” (collectively referred …

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STAP April Update: Super Stressful on All Fronts

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What’s going on with the STAP cell situation now that it is into its third month? It’s getting worse instead of better or clearer, at least in part due to RIKEN’s incomplete investigation. What’s going on with STAP? New RIKEN Press Conference RIKEN reportedly held an odd sort of limited press conference today that TJO …

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RIKEN Report Is Virtual Acid Bath of Criticism for Obokata

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RIKEN Institute in Japan has formally announced the complete findings of its investigation into the STAP cell research,  Haruko Obokata, and Nature papers. RIKEN almost entirely blamed Obokata for the STAP mess in this report and they didn’t mince words. The RIKEN report alleged that Obokata had engaged in two instances of “research misconduct” as …

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STAP Cell Nature Papers: Cases For & Against Retraction

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What next for STAP? Is retraction of the two papers on the near horizon? It has been two months now since Nature published the two papers on STAP cells and STAP stem cells. There has been a storm of controversy surrounding these papers and the claims they made to easily produce the most powerful of …

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STAP再現実験をより明解にするための1つの提案

By Jun Seita, M.D., Ph.D. Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine English version is here. Oct3/4プロモーターに制御されたGFP蛍光タンパク質の発現を検出することは、オリジナルのSTAP論文[1, 2]においてSTAP細胞の定義として広範囲にわたって使用されています。そして同じ手法はSTAP論文の再現を目指す様々な第三者にも利用されています。一方、ストレスや障害を受けた細胞が自家蛍光を発することは良く知られた現象です。これはSTAP細胞について議論する時に特に重要です。様々な外部刺激はOct3/4-GFPレポーターの活性化とは独立して自家蛍光の発現を促す可能性があるからです。フローサイトーメーターも蛍光顕微鏡も観察した蛍光の起源を、例えばGFP由来と特定することは出来ません。これらの機器は使用された励起光の種類と光学フィルターによって決定される、特定の波長域を持った光子の強度を測定するだけです。Oct3/4-GFP由来のシグナルを自家蛍光から区別することは、STAP細胞の再現実験において極めて重要な第一歩となります。すなわち、すでに著者達から発表されたプロトコール[3]をなぞるだけでは、弱酸処理によって終末分化細胞がOct3/4-GFPを発現する細胞に変化する、と確信するには不十分な可能性が示唆されます。 そこで、フローサイトーメトリーをよく使う一人の幹細胞生物学者として、プロトコールに1つのコントロールの追加を提案したいと思います。 Oct3/4-GFP遺伝子改変マウスから採取した細胞に追加して、野生型マウスからも同じ手順で細胞を採取し、同じ手順で外部刺激処理・培養し、同じ条件で解析を行ってください。  Oct3/4-GFP遺伝子改変マウスか野生型か、以外のすべての要素、マウスの系統、性別や週齢、弱酸処理の手順やそれに続く培養など、は同一である必要があります。これがOct3/4-GFPシグナルを自家蛍光から区別する唯一のコントロールとなります。この手法はFluorescence-minus-one (FMO) コントロールと呼ばれており、今日のフローサイトメトリーでは陽性細胞と陰性細胞の境界を決定するもっとも信頼のおける方法です。自家蛍光の波長分布や強度は、その細胞の状態に依存するので、ストレスを与えていないが培養した細胞はこの区別のためのコントロールとしては不適切です。これはプロトコールへのコントロールの追加であって、プロトコール自体を改変するものでないことにご留意ください。 Nature letter[2]のExtended Data Figure 5gに掲載されたフローサイトメトリーのデータは、コントロールの適切さ、そして更にいくつかの要素について再検討する必要性を示唆しました。フローサイトメトリーを行う場合には、各サンプルは全く同じ設定で観察する必要があります。検出の感度を決定する光電子倍増管の電圧設定や蛍光漏れ込み補正の設定は、実際のデータを取得する前に最適化し、サンプルとサンプルの間で変更するべきではありません。また論文の図表に掲載されたフローサイトメトリーの各プロットには観察に使用した蛍光色素・タンパク質の種類を明記することが推奨されています。発表された論文とプロトコール[1-3]を参照すると、eBioscienceが供給する抗CD90抗体は29種類、Abcamが供給する抗CD19抗体には22種類、Abcamが供給する抗CD34抗体には4種類、R&D Systemsが供給する抗Integrin alpha 7抗体には7種類の選択肢があります。この多様な選択肢は著者のプロトコールを正確に再現することを難しくしています。さらに、ほとんどの蛍光色素・タンパク質の蛍光波長域は、その蛍光色素・タンパク質用の検出器の検出波長域を超えて広がっているため、周囲の検出器へシグナルが漏れ込みます。そのため実験者は蛍光漏れ込み補正を行う必要があります。そして蛍光色素・タンパク質の組み合わせ、例えばGFPとPEと自家蛍光を同時に観察する場合、によっては漏れ込みを完全に補正することが難しいことが知られています。ですから使用された蛍光色素・タンパク質の組み合わせを知ることは、論文の図表に掲載されたフローサイトメトリーのプロットを解釈する際に極めて重要となります。もし電圧設定、蛍光漏れ込み補正、蛍光色素の組み合わせの選択やFMOが身近でない場合、フローサイトメトリー機器室の専門家に相談することを強くお勧めします。 この1つの、しかし重要なコントロールの追加はSTAP細胞の再現実験の結果をより明解にすると考えます。   References 1. Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency. Obokata H, Wakayama T, Sasai Y, …

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